Эцио, проживающий в Италии в эпоху Возрождения в конце 15-ого столетия, посчитал свою семью во Флоренции жертвами политического заговора, повлекшего за собой казнь его отца и двух братьев. Инструкции его отца приводят Эцио к сундуку, в котором находилось снаряжение ассасина. Дядя Эцио Марио позволяет ему, его матери и сестре укрыться в его загородном особняке, где и обучает Эцио искусству боя. Затем Марио выводит на предателей его семьи, и Эцио идет по следу из подсказок, ведущих от Флоренции до Сан Гимигнано, Форли, Венеции, и в конечном счете к Риму. По пути, он сталкивается с несколькими союзниками, которые помогают в его охоте. Это и Леонардо Да Винчи, который может помочь расшифровать рукописи Альтаира, создавая новое снаряжение. После убийства многих членов заговора, Эцио выходит на Родриго Боргиа, как лидера заговора, нацеленного подавить семью Медичи. Боргиа позже прибывает в Венецию с "Яблоком", "Частицей Эдема", который первоначально нашел Альтаир. Боргиа возомнил себя "пророком", который смог бы исследовать "Хранилище", где возможно хранится очень много Частиц Эдема и ценных свитков, что и ищут Тамплиеры. Эцио с союзниками, останавливает Боргиа, лишённого "Яблока". Его союзники, включая Никколо Макиавелли, показывают, что они все - члены ордена Ассасинов, говорят Эцио, что вероятно он - пророк, который приведет их к "Хранилищу".